Флуоресцентная микроскопия

Время чтения: 11 минут

Флуоресцентная микроскопия (англ. fluorescence microscopy) — метод получения увеличенного изображения объектов с искусственным возбуждением люминесценции. Данный метод исследования широко применяется в материаловедении, медицине, а также микробиологии.

Флуоресценция является частным случаем люминесценции, поэтому оба термина часто взаимозаменяемы.

В большинстве случаев излучаемый свет имеет большую длину волны и, следовательно, меньшую энергию фотона, чем поглощенное излучение (смещение Стокса). Наглядный пример – это, когда поглощенное излучение находится в ультрафиолетовой (УФ) области электромагнитного спектра (невидимой для человеческого глаза), а испускаемый свет находится в видимой области спектра.

Следует разделять фосфоресцирующие и флуоресцирующие вещества (ФВ). Первые обладают длительным послесвечением до 10 секунд. У ФВ время флуоресцентного света не превышает 10 микросекунд.

ФВ могут быть как органической, так и неорганической природы.

К неорганическим ФВ в основном относят люминофоры. Это вещества, при синтезе которых используют такие материалы как: вольфраматы, оксиды, полициклические ароматические соединения, силикаты, соединения редкоземельных элементов, а также халькогениды и фосфаты металлов второй группы (Be, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra).

В качестве примера можно рассмотреть флуоресценцию стекла, которую добивались внесением в его состав окислов урана. Такое стекло под действием синего, а также УФ излучения, создает красивое зеленоватое свечение. В России такое стекло носило название «Царское». Но его производство в мире практически полностью прекращено из-за опасности радиационного поражения людей.

Неорганические люминофоры применяют при создании флюоресцирующих экранов. Их используют в люминесцентных лампах, электронно-лучевых трубках, при изготовлении рентгеновских экранов, а также индикаторов радиации.

Органические ФВ не менее распространены. К ним относятся: антрацен, арилзамещенные этилены и оксазолы, карбазол, нафталин, пирен, тетрацен, белки, содержащие ароматические аминокислоты, а также многие пигменты растений, в том числе хлорофилл.

Органические люминофоры (органолюминофоры или люмогены) применяют в производстве флуоресцентных красок для окрашивания декоративных изделий, косметики, красок, пигментов для татуировок, пластмасс, полимерной глины и текстиля. Также органические ФВ используют для люминесцентной микроскопии в химии, биологии, медицине и криминалистике.

Флуорофоры – это красители, обладающие флуоресцентным свечением. Они представляют собой сложное химическое соединение, луминесцирующее под возбуждающим действием света. В состав флюорофоров входят несколько комбинированных ароматических групп ациклических или циклических молекул с несколькими π-связями. Чтобы в образце показать нужную молекулу, в его клетку вводят специальные антитела или белки, связанные с флуорофором. Эти белки с флуоресцирующей меткой и связываются с нужной молекулой в образце, которую нужно визуализировать.

В качестве примера можно привести краситель нуклеиновых кислот, такой как DAPI, а также фаллоидин, используемый при окрашивании в клетках млекопитающих актиновых волокон.

Основными элементами ФМС являются: источник света, фильтр возбуждения, объектив, дихроичное зеркало, а также эмиссионный фильтр.

В освещении препаратов может использоваться один из четырех основных типов:

Во флуоресцентной микроскопии лазерные источники в основном используются в сложных методах исследования. Ксеноновые и ртутные лампы, а также светодиоды обычно применяют в широкопольных эпифлуоресцентных микроскопов (МС), в сочетании с дихроичными возбуждающими фильтрами.

Возбуждающий фильтр представляет собой фильтр с узкой полосой пропускания в определённом диапазоне спектра. Полученный узкий диапазон света используется при освещении исследуемого образца. Когда флуорофоры в нем освещаются с соответствующей длиной волны, то они излучают флуоресцентное излучение с большей длиной. Использование фильтра уменьшает вероятность возникновения флуоресценции в образце от других источников.

Применяемая в объективе линза является ключевым элементом МС. Она используется для получения нужного увеличения наблюдаемого препарата. Объектив расположен близко к образцу, в нижней части револьверной головки МС.

Образец, размещенный на предметном стекле, освещается возбуждающей волной, которая проходит через объектив. При этом возбужденный свет возвращается через нее обратно, создавая изображение в окуляре или видеокамере. Качество объектива имеет решающее значение для определения разрешения и четкости изображения, создаваемого микроскопом.

Тонкопленочный дихроичный зеркальный фильтр — это оптическое устройство, выполняющее функции фильтра и используемого для выборочного прохождения света. Зеркальный фильтр отражает возбуждающее излучение, идущее к препарату, а также пропускает излучаемый им свет.

Фильтр излучения также является полосовым фильтром. Второе его название – эмиссионный фильтр.

Его функция – это пропускание волн света только с определенной длиной, которая соответствует излучению флуорофора. Он блокирует весь нежелательный свет за пределами этой полосы, в том числе УФ и ИК излучение, а также автофлуоресценцию образца или оптической системы. Его применение гарантирует, что к обнаружению будет принят только излучаемый свет.

Все элементы оптической системы тщательно подбираются, чтобы соответствовать длине волн возбуждающего и испускаемого образцом излучения. Это помогает увидеть распределение одиночных молекул флуорофора, обеспечивая их точное изображение.

Сочетание всех этих факторов дает ФМС предпочтительным перед другими методами оптической визуализации как для in vitro, так и in vivo.

Это важный показатель, используемый для описания способности различать МС детали в образце. Он определяется минимальным расстоянием между двумя отдельными точками в исследуемом образце, которое все еще позволяет воспринимать их как отдельные объекты.

Эти характеристики являются определяющими факторами для оценки разрешения систем оптического микроскопа. Максимально достижимый предел разрешающей способности составляет приблизительно 200 нм.

Дугоразрядные ртутные и ксеноновые лампы, постепенно уступают своё место мощным светодиодам (LED). К их достоинствам относятся: высокий срок службы, быстрый старт и выключение, высокая стабильность излучения и низкая рабочая температура. Светодиодные источники энергоэффективны, а также экологически безопасны.

Нижнее освещение удобно при исследовании прозрачных и полупрозрачных образцов invitro (в чашке Петри). Верхнее предпочтительнее для непрозрачных или объемных объектов. В случае применения обоих методов – разработаны конструкции микроскопов с комбинированным освещением.

Третий окуляр упрощает работу по фиксации, а также дальнейшей обработке результатов исследований. Размещаемая в нем цифровая камера позволяет вести трансляцию результатов работы на отдельный монитор, локальную сеть или интернет.