Флуоресцентная микроскопия

Люминесцентные микроскопы

Впервые явление флюоресценции было подробно изучено Джорджем Стоксом в середине XIX века.

А в микроскопии его наблюдал Август Кёльер. В 1904 году, в попытках создания первого ультрафиолетового микроскопа. Но посчитал, что «… это затрудняет, если не делает невозможным, восприятие изображения, создаваемого ультрафиолетовыми лучами…». Однако отметил потенциальную пользу люминесцентного исследования.

Уже через семь лет появляются первые коммерческие микроскопы, а к 40-м годам разрабатываются флуоресцентные красители расширяющие возможности исследователей.

Время чтения: 11 минут

Флуоресцентная микроскопия (англ. fluorescence microscopy) — метод получения увеличенного изображения объектов с искусственным возбуждением люминесценции. Данный метод исследования широко применяется в материаловедении, медицине, а также микробиологии.

Что значит флуоресцентный

Флуоресценция – это явление, заключающееся в испускании света веществом, на которое предварительно воздействовали светом или другим электромагнитным излучением (ЭМИ).

Флуоресценция является частным случаем люминесценции, поэтому оба термина часто взаимозаменяемы.

В большинстве случаев излучаемый свет имеет большую длину волны и, следовательно, меньшую энергию фотона, чем поглощенное излучение (смещение Стокса). Наглядный пример – это, когда поглощенное излучение находится в ультрафиолетовой (УФ) области электромагнитного спектра (невидимой для человеческого глаза), а испускаемый свет находится в видимой области спектра.

особенность люминесцентной микроскопии
Смещение Стокса на примере витамина B2. Спектр поглощения (оранжевый) и спектр флуоресценции (синий)

Вещества, обладающие флуоресценцией

Следует разделять фосфоресцирующие и флуоресцирующие вещества (ФВ). Первые обладают длительным послесвечением до 10 секунд. У ФВ время флуоресцентного света не превышает 10 микросекунд.

ФВ могут быть как органической, так и неорганической природы.

Неорганические

К неорганическим ФВ в основном относят люминофоры. Это вещества, при синтезе которых используют такие материалы как: вольфраматы, оксиды, полициклические ароматические соединения, силикаты, соединения редкоземельных элементов, а также халькогениды и фосфаты металлов второй группы (Be, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra).

В качестве примера можно рассмотреть флуоресценцию стекла, которую добивались внесением в его состав окислов урана. Такое стекло под действием синего, а также УФ излучения, создает красивое зеленоватое свечение. В России такое стекло носило название «Царское». Но его производство в мире практически полностью прекращено из-за опасности радиационного поражения людей.

флюоресцентный свет
Урановое стекло при дневном свете (сверху) и в УФ излучении (снизу)

Неорганические люминофоры применяют при создании флюоресцирующих экранов. Их используют в люминесцентных лампах, электронно-лучевых трубках, при изготовлении рентгеновских экранов, а также индикаторов радиации.

Органические

Органические ФВ не менее распространены. К ним относятся: антрацен, арилзамещенные этилены и оксазолы, карбазол, нафталин, пирен, тетрацен, белки, содержащие ароматические аминокислоты, а также многие пигменты растений, в том числе хлорофилл.

Органические люминофоры (органолюминофоры или люмогены) применяют в производстве флуоресцентных красок для окрашивания декоративных изделий, косметики, красок, пигментов для татуировок, пластмасс, полимерной глины и текстиля. Также органические ФВ используют для люминесцентной микроскопии в химии, биологии, медицине и криминалистике.

флюоресцентный метод анализа
Люминесцентная микроскопия в микробиологии(кишечник личинки дрозофилы)

Принцип работы люминесцентного микроскопа

Флуоресцентный микроскоп (ФМС) – это высокоэффективный инструмент визуализации в микробиологии. Его основное назначение – исследование пространственной и функциональной характеристик биомолекул, проявляющих аутофлуоресценцию в своей естественной среде, например, в клетке или тканях, а также для молекул, которые помечены флуоресцентными молекулами для экзогенной УФ флуоресценции.

Флуорофоры

Флуорофоры – это красители, обладающие флуоресцентным свечением. Они представляют собой сложное химическое соединение, луминесцирующее под возбуждающим действием света. В состав флюорофоров входят несколько комбинированных ароматических групп ациклических или циклических молекул с несколькими π-связями. Чтобы в образце показать нужную молекулу, в его клетку вводят специальные антитела или белки, связанные с флуорофором. Эти белки с флуоресцирующей меткой и связываются с нужной молекулой в образце, которую нужно визуализировать.

В качестве примера можно привести краситель нуклеиновых кислот, такой как DAPI, а также фаллоидин, используемый при окрашивании в клетках млекопитающих актиновых волокон.

флюоресцентные цвета
Цвет флуоресцентных веществ в ультрафиолете

Устройство микроскопа

Основными элементами ФМС являются: источник света, фильтр возбуждения, объектив, дихроичное зеркало, а также эмиссионный фильтр.

флуоресцентный микроскоп купить в Суперайс
Общее устройство люминесцентного микроскопа

Источник света

В освещении препаратов может использоваться один из четырех основных типов:

  • дуговые ксеноновые лампы;
  • дуговые ртутные лампы;
  • лазеры;
  • LED-светодиоды высокой мощности.

Во флуоресцентной микроскопии лазерные источники в основном используются в сложных методах исследования. Ксеноновые и ртутные лампы, а также светодиоды обычно применяют в широкопольных эпифлуоресцентных микроскопов (МС), в сочетании с дихроичными возбуждающими фильтрами.

Фильтр возбуждения

Возбуждающий фильтр представляет собой фильтр с узкой полосой пропускания в определённом диапазоне спектра. Полученный узкий диапазон света используется при освещении исследуемого образца. Когда флуорофоры в нем освещаются с соответствующей длиной волны, то они излучают флуоресцентное излучение с большей длиной. Использование фильтра уменьшает вероятность возникновения флуоресценции в образце от других источников.

Объектив

Применяемая в объективе линза является ключевым элементом МС. Она используется для получения нужного увеличения наблюдаемого препарата. Объектив расположен близко к образцу, в нижней части револьверной головки МС.

Образец, размещенный на предметном стекле, освещается возбуждающей волной, которая проходит через объектив. При этом возбужденный свет возвращается через нее обратно, создавая изображение в окуляре или видеокамере. Качество объектива имеет решающее значение для определения разрешения и четкости изображения, создаваемого микроскопом.

купить объектив для микроскопа в Суперайс
Объективы для люминесцентного микроскопа Infinity PlanSemi-APO

Дихроичное зеркало

Тонкопленочный дихроичный зеркальный фильтр — это оптическое устройство, выполняющее функции фильтра и используемого для выборочного прохождения света. Зеркальный фильтр отражает возбуждающее излучение, идущее к препарату, а также пропускает излучаемый им свет.

Фильтр излучения

Фильтр излучения также является полосовым фильтром. Второе его название – эмиссионный фильтр.

Его функция – это пропускание волн света только с определенной длиной, которая соответствует излучению флуорофора. Он блокирует весь нежелательный свет за пределами этой полосы, в том числе УФ и ИК излучение, а также автофлуоресценцию образца или оптической системы. Его применение гарантирует, что к обнаружению будет принят только излучаемый свет.

Все элементы оптической системы тщательно подбираются, чтобы соответствовать длине волн возбуждающего и испускаемого образцом излучения. Это помогает увидеть распределение одиночных молекул флуорофора, обеспечивая их точное изображение.

Применение ФМС

  • Флуоресцентный метод анализа позволяет обнаруживать различие между предметами, кажущимися одинаковыми в оптическом спектре.
  • В микробиологии этот метод применяется для диагностики заболеваний, определения поражённости семян и растений болезнями, определения содержания органических веществ в почве.
  • Он позволяет использовать многоцветное окрашивание, маркировать структуры внутри клеток и измерять физиологическое состояние клетки.
  • В геологии с помощью люминесцентной микроскопии производят анализ горных пород для обнаружения полезных ископаемых, изучают состав нефти, минералов, структуру горных пород.
  • В ювелирном деле проводят оценку качества полудрагоценных и драгоценных камней, строят автоматическое сортировочное оборудование.
  • В материаловедении метод флуоресцентной микроскопии применяется для оценки качества оптического стекла, полимерных, композитных, а также других материалов.
флюоресцентные цвета
Флюоресценция камня

Преимущества люминесцентного метода исследования

  • Возможность визуализации структуры клеток и тканей, изучения физиологии, функций, а также поведение.
  • Флуоресцентная микроскопия является наиболее популярным методом изучения динамического поведения живых клеток. Это связано с её способностью выделять отдельные белки с высокой степенью специфичности среди нефлуоресцирующего материала.
  • Высокая чувствительность. Чтобы обнаружить вещество, достаточно всего его 50 молекул на кубический микрометр.
  • Возможность окрашивания разных молекул разными цветами. Это позволяет отслеживать одновременно несколько типов молекул.

Сочетание всех этих факторов дает ФМС предпочтительным перед другими методами оптической визуализации как для in vitro, так и in vivo.

флюоресцентная краска для микроскопа
Люминесценция клеток

Ограничения применения

  • Флуорофоры обладают свойством потери способности флуоресцировать в освещении. Это происходит из-за фотообесцвечивания. Оно нарастает по мере того, как люминесцентные молекулы накапливают повреждения, возникающие от возбужденных электронов.
  • Клеточный материал восприимчив к фототоксичности. Особенно сильно оно проявляется от света с короткой длиной волны. Помимо этого, флуоресцентные материалы при освещении обладают способностью к генерации реактивных химикатов. Это еще сильнее влияет на эффект фототоксичности.
  • Флуоресцентная микроскопия дает возможность к наблюдению только тех структур, которые окрашены флюорофорами. Это отличает ее от методов оптической микроскопии в отраженном, а также проходящем свете. Не позволяя наблюдать весь объект исследования.

Критерии выбора ФМС

Разрешение микроскопа

Это важный показатель, используемый для описания способности различать МС детали в образце. Он определяется минимальным расстоянием между двумя отдельными точками в исследуемом образце, которое все еще позволяет воспринимать их как отдельные объекты.

Числовая апертура (NA) и длина волны света

Эти характеристики являются определяющими факторами для оценки разрешения систем оптического микроскопа. Максимально достижимый предел разрешающей способности составляет приблизительно 200 нм.

Тип подсветки

Дугоразрядные ртутные и ксеноновые лампы, постепенно уступают своё место мощным светодиодам (LED). К их достоинствам относятся: высокий срок службы, быстрый старт и выключение, высокая стабильность излучения и низкая рабочая температура. Светодиодные источники энергоэффективны, а также экологически безопасны.

Расположение подсветки

Нижнее освещение удобно при исследовании прозрачных и полупрозрачных образцов invitro (в чашке Петри). Верхнее предпочтительнее для непрозрачных или объемных объектов. В случае применения обоих методов – разработаны конструкции микроскопов с комбинированным освещением.

Наличие тринокулярной насадки

Третий окуляр упрощает работу по фиксации, а также дальнейшей обработке результатов исследований. Размещаемая в нем цифровая камера позволяет вести трансляцию результатов работы на отдельный монитор, локальную сеть или интернет.

купить микроскоп opto edu в суперайс
ФМС Opto-Edu: прямой A16.2603-L-T4 (слева) и инвертированный A16.2615-L-4 (справа)

Заключение

Флуоресцентная микроскопия позволила различить и исследовать вещества со схожими оптическими характеристиками, но различающихся реакцией на УФ-излучение. Она позволила ученым прийти к новым открытиям, по-новому взглянуть на уже известные структуры, а также процессы, протекающие в живых организмах.


Количество показов: 2304
28.06.2023
Понравилась статья? Поделитесь ей в ваших социальных сетях:

Возврат к списку