Иммерсионная микроскопия. Жидкости, применяемые при микроскопическом исследовании

Время чтения: 16 минут

Основная проблема световой микроскопии это преодоление ограничений оптического разрешения, а также увеличение числовой апертуры (NA) системы. В частности, числовая апертура — это способность оптической системы собирать свет, тогда как разрешение — это способность различать детали. Для получения изображения образцов при большом увеличении, а также преодоление ограничений в разрешении используют метод иммерсии. Когда свет переходит из одной среды в другую, например, через стекло в воздух, он преломляется и рассеивается. Искривленные лучи света рассеиваются на большую площадь попадая за пределы передней линзы, и не участвуют в формировании изображения.

Замена воздушного зазора между передней линзой объектива и покровным стеклом специальной жидкостью значительно увеличивает разрешающую способность. Она уменьшает степень искажения света, что позволяет большему числу лучей фокусироваться на линзе. В этом и заключается принцип иммерсионной микроскопии.

Физические свойства среды, через которую проходят световые лучи, определяют степень искривления света. Коэффициент преломления (КП) - это числовое значение выраженное в относительных единицах, которое определяет степень искажения света при прохождении им через материал. Так воздух имеет КП равный 1, тогда как предметные и покровные стекла обычно имеют КП равный 1,5. Принимая во внимание эту разницу, задача иммерсионной жидкости состоит в том, чтобы коэффициенты преломления всех сред на пути света были максимально близки друг к другу, что уменьшит рассеивание световых лучей, формирующих конечное изображение. Поэтому большинство подобных веществ имеют показатель близкий к 1,51.

Однородная или гомогенная иммерсионная система – это совокупность передней линзы, буферного состава, покровного стекла или слайда, монтажного состава и, в идеале, линзы конденсора обладающих близкими оптическими характеристиками. Элементы этой системы имеют близкие друг другу КП, что позволяет добиться максимального разрешения и числовой апертуры.

Наносить иммерсионный состав на линзу конденсора обычно не нужно, если микроскоп правильно настроен и отрегулирован для достижения оптимального контраста и освещения по всему препарату. В таком случае положение и настройки конденсора будут оптимальными, что обеспечивает максимальную числовую апертуру микроскопической системы.

Рабочее расстояние – это еще один фактор, который учитывается при выборе объективов. Оно определяется как фактическое расстояние от поверхности препарата до передней линзы, когда изображение находится в резком фокусе. Когда объектив перемещается ближе к предметному стеклу, фокальная плоскость перемещается дальше в препарат. Однако это движение физически ограничено тем, что приближать только до тех пор, пока не произойдет соприкосновение с исследуемым объектом.

Существует обратная зависимость между увеличением и рабочим расстоянием, например, для объектива Saike Digital Plan с 10-кратным увеличением оно равно 6,6 мм, тогда как для масляного Saike Digital Plan 100x OIL оно уже составляет около 0,13 мм, а 40-кратный Saike Digital Plan эффективен на расстоянии в 0,47 мм. При этом существуют водоиммерсионные устройства с увеличенным фокусом имеющим около 3 мм рабочего расстояния. Этот индивидуальный показатель, обычно указывается в технической документации и может быть определен расчетным путем через значение апертуры, коэффициента преломления среды и диаметра линзы.

Важнейшим фактором, который нужно помнить при применении масляной иммерсии, это верно подобранное масло, поэтому применяйте только то, что рекомендовано производителем оптики. Многие годы для этих целей применяли кедровое масло, и оно до сих пор продается. Оно имеет показатель преломления 1,516, но обладает тенденцией к затвердеванию, что может привести к повреждению линзы, если его вовремя не удалить после применения. Помимо того, кедровое масло поглощает синий и ультрафиолетовый свет, что ведет к постепенному изменению его цвета, пожелтению.

Большинство существующих на рынке масел производятся синтетическим путем и жестко стандартизируется, чтобы гарантировать, безопасность оптики и сохранения собственного цвета. Однако нужно помнить, что любое масло также имеет оптимальную рабочую температуру. Большинство находящихся в продаже синтетических масел рассчитано на работу при температуре 23°C, и изменение её всего на один градус приведет к изменению показателя преломления на 0,0004. Доступны и другие, которые эффективно работают в некотором диапазоне температур, но для большинства задач необходимо поддерживать стабильную температуру в 23°C. Особенно необходимо учитывать температурный режим при работе с конфокальными микроскопами.

Для масляной иммерсии в флуоресцентной микроскопии рекомендуется использовать специальное масло с низким показателем автофлуоресценции. Причина в том, что многие из веществ флуоресцируют в случае если в спектре проходящего света присутствует синяя или ультрафиолетовая составляющая спектра. Все масла для флуоресцентной микроскопии идентифицируются по наличию буквы «F» вначале или в конце своего названия или кода.

Водноиммерсионные объективы – менее распространены и редко применяются в микроскопах исследовательского класса, особенно в конфокальных системах. Они используются аналогично масляным, и их отличают по наличию на корпусе маркировки в виде аббревиатуры "WI" (water immersion) или просто "W" (water). Водную иммерсию предпочтительно применять при визуализации живых клеток, находящихся в клеточной среде. Существует два типа подобных объективов – это "водоиммерсионный" и "водопогружной". Водопогружные обычно маркируются аббревиатурой "WD" (water dipping) размещаемой на их корпусе.

Погружаемые в воду объективы обычно задействованы в иммерсионных микроскопах с вертикальной конфигурацией и предназначены для погружения непосредственно в воду или среду/буфер на водной основе. Они изготавливаются таким образом, чтобы обеспечить очень большое рабочее расстояние. Кроме того, они имеют круто наклоненную носовую часть, изготовленную из инертного материала, например, керамики.

Преимущество применения водной иммерсии заключается в том, что в качестве заполнителя используется вода, которую легко наносить и смывать. Кроме того, не нужно использовать специальные составы и выбирать их в зависимости от выполняемой визуализации или рекомендаций производителя.

Однако при использовании водной иммерсии имеются некоторые недостатки. Так при использовании масляных составов достигается более высокое разрешение. Также из-за меньшей вязкости, по сравнению с более густыми веществами, водная среда более чувствительна к вибрациям, а также небольшим движениям воздуха.

Последний недостаток можно устранить, используя антивибрационный предметный столик, или же в качестве альтернативы применяют специальное кольцо, которое устанавливается на предметное стекло и создает небольшой бассейн со спокойной водой. Еще один недостаток водоиммерсии – это высокая стоимость объективов. Некоторые из них могут стоить столько же, сколько полноценный микроскоп исследовательского уровня.

Дополнительно ко всему, вода подвержена постепенному испарению, поэтому некоторые производители предлагают насадку-микродиспенсер, которая позволяет решить потенциальную проблему испарения воды во время длительных экспериментов по визуализации живых клеток или при скрининге.

В целом, преимущество водоиммерсии заключается в эффективной визуализации живых клеток и тканей. Это главным образом связано с тем, что масляная иммерсия не предназначена для получения изображений от препаратов размещенных в перфузионных, культуральных или визуализационных камерах, что часто используется в микроскопии живых клеток.

Живые клетки обычно содержатся внутри емкости, а также покрыты клеточной средой или буфером, что позволяет обеспечить стабильность биологических условий для клеток или тканей во время визуализации. Как следствие, оптимальное фокусное расстояние будет находиться на относительно большом расстоянии от крышки камеры. Это обстоятельство делает короткое рабочее расстояние масляно-иммерсионных объективов нецелесообразным для визуализации клеток или тканей через стеклянную покровную пластину или камеру, а также буферное вещество.

Кроме того, использование масляной иммерсии для просмотра клеток в водной среде создает дополнительные проблемы с искажением света, поскольку они имеют разные показатели преломления.

При наблюдении живых клеток в ёмкостях на пути света будут встречаться вещества с разными коэффициентами преломления. Материал камеры или крышки, водная среда, покрывающая клетки или ткани, все они имеют разный коэффициент преломления. Свет, формирующий изображение образца, будет преломляться на каждой границе раздела сред, что ведет к появлению сферических аберраций.

Несмотря на рефракцию, которая возникает на границе воды, а также покрова из стекла или пластика, на этапе производства водоиммерсионные объективы корректируются с учетом этого явления. Кроме того, некоторые из них оснащены корректирующими манжетами (кольцами). Они расположены на внешней части корпуса и при их помощи можно выполнить регулировку оптики в зависимости от толщины покровного стекла.

Существуют также корректирующие манжеты оснащенные электроприводом, они позволяют дистанционно и с высокой точностью выполнять настройку оптимального разрешения с минимальными влияниями на работу при изучении образцов.

Одной из наиболее подходящих областей применения водоиммерсии является конфокальная микроскопия при визуализации живых клеток, по этой причине водоиммерсионные часто объективы входят в стандартную комплектацию большинства конфокальных микроскопов.

Благодаря более низкой вязкости, использование воды приводит к снижению поверхностного натяжения на покровном стекле, что приводит к уменьшению вероятности смещения препарата, особенно при получении Z-стеков.

Глицерин – еще одно вещество задействованное в иммерсии для множества фиксированных образцов. Смеси на основе глицерина имеют высокий коэффициент преломления, например, для смеси из 80% глицерина и 20% воды он равен 1,45. Для препаратов, размещаемых в таких составах, лучше всего подходят глицериновые объективы, узнать из можно по соответствующей маркировке «GLYC» нанесенной на корпусе.