Иммерсионная микроскопия. Жидкости, применяемые при микроскопическом исследовании

Иммерсионная микроскопия. Жидкости, применяемые при микроскопическом исследовании

иммерсионная микроскопия принцип

При исследовании образцов на большом увеличении учитывают ряд факторов, таких как: разрешение, рабочее расстояние, числовая апертура, а также коэффициент преломления среды, через которую проходит свет. В 1812 году Дэвид Брюстер предложил применить иммерсию для устранения хроматических аберраций. И уже к 1840 году были сконструированы первые иммерсионные объективы. В последующие годы продолжалось совершенствование их конструкции, а также подбирались оптимальные иммерсионные составы, что способствовало значительному улучшению качества изображения.

Время чтения: 16 минут

Иммерсионные вещества

Основная проблема световой микроскопии это преодоление ограничений оптического разрешения, а также увеличение числовой апертуры (NA) системы. В частности, числовая апертура — это способность оптической системы собирать свет, тогда как разрешение — это способность различать детали. Для получения изображения образцов при большом увеличении, а также преодоление ограничений в разрешении используют метод иммерсии. Когда свет переходит из одной среды в другую, например, через стекло в воздух, он преломляется и рассеивается. Искривленные лучи света рассеиваются на большую площадь попадая за пределы передней линзы, и не участвуют в формировании изображения.

Замена воздушного зазора между передней линзой объектива и покровным стеклом специальной жидкостью значительно увеличивает разрешающую способность. Она уменьшает степень искажения света, что позволяет большему числу лучей фокусироваться на линзе. В этом и заключается принцип иммерсионной микроскопии.

жидкости в микроскопии
Слева, ситуация когда свет преломляется проходя через две среды с разными коэффициентами преломления
Справа, ситуация, когда применяется специальная жидкость, уменьшающая искажение света

Коэффициент искривления света

Физические свойства среды, через которую проходят световые лучи, определяют степень искривления света. Коэффициент преломления (КП) - это числовое значение выраженное в относительных единицах, которое определяет степень искажения света при прохождении им через материал. Так воздух имеет КП равный 1, тогда как предметные и покровные стекла обычно имеют КП равный 1,5. Принимая во внимание эту разницу, задача иммерсионной жидкости состоит в том, чтобы коэффициенты преломления всех сред на пути света были максимально близки друг к другу, что уменьшит рассеивание световых лучей, формирующих конечное изображение. Поэтому большинство подобных веществ имеют показатель близкий к 1,51.

показатели преломления таблица
Характеристики различных веществ, типов стёкол, а также сред для закрепления образцов

Гомогенная оптическая система

Однородная или гомогенная иммерсионная система – это совокупность передней линзы, буферного состава, покровного стекла или слайда, монтажного состава и, в идеале, линзы конденсора обладающих близкими оптическими характеристиками. Элементы этой системы имеют близкие друг другу КП, что позволяет добиться максимального разрешения и числовой апертуры.

влияние преломления
Показатели преломления всех оптических элементов между препаратом и передней линзой оказывают большое влияние на качество изображения

Наносить иммерсионный состав на линзу конденсора обычно не нужно, если микроскоп правильно настроен и отрегулирован для достижения оптимального контраста и освещения по всему препарату. В таком случае положение и настройки конденсора будут оптимальными, что обеспечивает максимальную числовую апертуру микроскопической системы.

Рабочее расстояние

Рабочее расстояние – это еще один фактор, который учитывается при выборе объективов. Оно определяется как фактическое расстояние от поверхности препарата до передней линзы, когда изображение находится в резком фокусе. Когда объектив перемещается ближе к предметному стеклу, фокальная плоскость перемещается дальше в препарат. Однако это движение физически ограничено тем, что приближать только до тех пор, пока не произойдет соприкосновение с исследуемым объектом.

что такое рабочее расстояние
Общая схема демонстрирующая рабочее расстояние

Существует обратная зависимость между увеличением и рабочим расстоянием, например, для объектива Saike Digital Plan с 10-кратным увеличением оно равно 6,6 мм, тогда как для масляного Saike Digital Plan 100x OIL оно уже составляет около 0,13 мм, а 40-кратный Saike Digital Plan эффективен на расстоянии в 0,47 мм. При этом существуют водоиммерсионные устройства с увеличенным фокусом имеющим около 3 мм рабочего расстояния. Этот индивидуальный показатель, обычно указывается в технической документации и может быть определен расчетным путем через значение апертуры, коэффициента преломления среды и диаметра линзы.

объективы для микроскопа купить
Объективы Saike Digital различных увеличений

Иммерсионное масло для микроскопии

Важнейшим фактором, который нужно помнить при применении масляной иммерсии, это верно подобранное масло, поэтому применяйте только то, что рекомендовано производителем оптики. Многие годы для этих целей применяли кедровое масло, и оно до сих пор продается. Оно имеет показатель преломления 1,516, но обладает тенденцией к затвердеванию, что может привести к повреждению линзы, если его вовремя не удалить после применения. Помимо того, кедровое масло поглощает синий и ультрафиолетовый свет, что ведет к постепенному изменению его цвета, пожелтению.

масляный объектив
Объектив для масляно-иммерсионной микроскопии имеют маркировку «OIL» (масло) на своем корпусе

Большинство существующих на рынке масел производятся синтетическим путем и жестко стандартизируется, чтобы гарантировать, безопасность оптики и сохранения собственного цвета. Однако нужно помнить, что любое масло также имеет оптимальную рабочую температуру. Большинство находящихся в продаже синтетических масел рассчитано на работу при температуре 23°C, и изменение её всего на один градус приведет к изменению показателя преломления на 0,0004. Доступны и другие, которые эффективно работают в некотором диапазоне температур, но для большинства задач необходимо поддерживать стабильную температуру в 23°C. Особенно необходимо учитывать температурный режим при работе с конфокальными микроскопами.

Для масляной иммерсии в флуоресцентной микроскопии рекомендуется использовать специальное масло с низким показателем автофлуоресценции. Причина в том, что многие из веществ флуоресцируют в случае если в спектре проходящего света присутствует синяя или ультрафиолетовая составляющая спектра. Все масла для флуоресцентной микроскопии идентифицируются по наличию буквы «F» вначале или в конце своего названия или кода.

Правила работы с иммерсионной системой

  • Начните просмотр образца на небольшое увеличение, например с 4 или 10 крат. Это позволит быстро найти интересующую вас область на образце.
  • Перейдите к увеличению 40x или 60х, а также настройте на микроскопе освещение по Келеру.
  • Поверните револьверную головку в промежуточное положение между объективом 100 кратного увеличения и любым другим ближайшим к нему.
  • Глядя сбоку, осторожно нанесите одну каплю иммерсионного масла прямо на покровное стекло. Установите 100-кратный объектив в рабочее положение и продолжая наблюдать с боку задействуйте грубую, а затем точную фокусировку, чтобы привести переднюю линзу в контакт с каплей. Некоторые линзы имеют вогнутую форму, а это означает, что дополнительно нужно добавить каплю масла и на неё поверхности. Этот способ позволит предотвратить образование пузырьков воздуха.
  • Далее наблюдая в окуляры воспользуйтесь только точную фокусировку для настройки четкости поля зрения. Хотя большинство объективов с большим увеличением имеют подпружиненную переднюю часть, грубая фокусировка на этом этапе может легко привести к растрескиванию покровного стекла, повредить образец, а также повредить фронтальную линзу.
  • По окончании работы, даже если планируется исследовать другие образцы, все равно нужно удалить остатки масла, чтобы предотвратить любое потенциальное загрязнение каких-либо частей микроскопа. Иммерсионные составы могут (и будут) проникать внутрь, постепенно загрязняя и повреждая элементы микроскопа и объективов в частности, особенно если они не предназначенные для иммерсии. Удалите излишки салфеткой для очистки оптики, проведя одним легким движением по линзе. Далее протирайте её чистым куском ткани до тех пор, пока не останется никаких следов масла. Для окончательной очистки можно использовать специальные коммерческие растворы или небольшое количество ксилола. Однако, перед использованием любых растворов для очистки оптики необходимо изучить рекомендации производителя по пользованию.

Вода

Водноиммерсионные объективы – менее распространены и редко применяются в микроскопах исследовательского класса, особенно в конфокальных системах. Они используются аналогично масляным, и их отличают по наличию на корпусе маркировки в виде аббревиатуры "WI" (water immersion) или просто "W" (water). Водную иммерсию предпочтительно применять при визуализации живых клеток, находящихся в клеточной среде. Существует два типа подобных объективов – это "водоиммерсионный" и "водопогружной". Водопогружные обычно маркируются аббревиатурой "WD" (water dipping) размещаемой на их корпусе.

водная иммерсия
Объектив водопогружной с инертным наконечником и большим рабочим расстоянием

Погружаемые в воду объективы обычно задействованы в иммерсионных микроскопах с вертикальной конфигурацией и предназначены для погружения непосредственно в воду или среду/буфер на водной основе. Они изготавливаются таким образом, чтобы обеспечить очень большое рабочее расстояние. Кроме того, они имеют круто наклоненную носовую часть, изготовленную из инертного материала, например, керамики.

Преимущество применения водной иммерсии заключается в том, что в качестве заполнителя используется вода, которую легко наносить и смывать. Кроме того, не нужно использовать специальные составы и выбирать их в зависимости от выполняемой визуализации или рекомендаций производителя.

Однако при использовании водной иммерсии имеются некоторые недостатки. Так при использовании масляных составов достигается более высокое разрешение. Также из-за меньшей вязкости, по сравнению с более густыми веществами, водная среда более чувствительна к вибрациям, а также небольшим движениям воздуха.

Последний недостаток можно устранить, используя антивибрационный предметный столик, или же в качестве альтернативы применяют специальное кольцо, которое устанавливается на предметное стекло и создает небольшой бассейн со спокойной водой. Еще один недостаток водоиммерсии – это высокая стоимость объективов. Некоторые из них могут стоить столько же, сколько полноценный микроскоп исследовательского уровня.

Дополнительно ко всему, вода подвержена постепенному испарению, поэтому некоторые производители предлагают насадку-микродиспенсер, которая позволяет решить потенциальную проблему испарения воды во время длительных экспериментов по визуализации живых клеток или при скрининге.

дозатор для подачи воды
Микродозатор для автоматической подачи воды и поддержания достаточного ее объема во время длительных исследований

В целом, преимущество водоиммерсии заключается в эффективной визуализации живых клеток и тканей. Это главным образом связано с тем, что масляная иммерсия не предназначена для получения изображений от препаратов размещенных в перфузионных, культуральных или визуализационных камерах, что часто используется в микроскопии живых клеток.

Исследование биологических образцов

Живые клетки обычно содержатся внутри емкости, а также покрыты клеточной средой или буфером, что позволяет обеспечить стабильность биологических условий для клеток или тканей во время визуализации. Как следствие, оптимальное фокусное расстояние будет находиться на относительно большом расстоянии от крышки камеры. Это обстоятельство делает короткое рабочее расстояние масляно-иммерсионных объективов нецелесообразным для визуализации клеток или тканей через стеклянную покровную пластину или камеру, а также буферное вещество.

Кроме того, использование масляной иммерсии для просмотра клеток в водной среде создает дополнительные проблемы с искажением света, поскольку они имеют разные показатели преломления.

При наблюдении живых клеток в ёмкостях на пути света будут встречаться вещества с разными коэффициентами преломления. Материал камеры или крышки, водная среда, покрывающая клетки или ткани, все они имеют разный коэффициент преломления. Свет, формирующий изображение образца, будет преломляться на каждой границе раздела сред, что ведет к появлению сферических аберраций.

Корректирующее кольцо

Несмотря на рефракцию, которая возникает на границе воды, а также покрова из стекла или пластика, на этапе производства водоиммерсионные объективы корректируются с учетом этого явления. Кроме того, некоторые из них оснащены корректирующими манжетами (кольцами). Они расположены на внешней части корпуса и при их помощи можно выполнить регулировку оптики в зависимости от толщины покровного стекла.

Существуют также корректирующие манжеты оснащенные электроприводом, они позволяют дистанционно и с высокой точностью выполнять настройку оптимального разрешения с минимальными влияниями на работу при изучении образцов.

корректирующее кольцо
Моторизированная корректирующая насадка оснащенная электроприводом (слева) и корректирующее кольцо с ручной регулировкой (справа)

Водоиммерсионные исследования в конфокальной микроскопии

Одной из наиболее подходящих областей применения водоиммерсии является конфокальная микроскопия при визуализации живых клеток, по этой причине водоиммерсионные часто объективы входят в стандартную комплектацию большинства конфокальных микроскопов.

Благодаря более низкой вязкости, использование воды приводит к снижению поверхностного натяжения на покровном стекле, что приводит к уменьшению вероятности смещения препарата, особенно при получении Z-стеков.

Глицерин

Глицерин – еще одно вещество задействованное в иммерсии для множества фиксированных образцов. Смеси на основе глицерина имеют высокий коэффициент преломления, например, для смеси из 80% глицерина и 20% воды он равен 1,45. Для препаратов, размещаемых в таких составах, лучше всего подходят глицериновые объективы, узнать из можно по соответствующей маркировке «GLYC» нанесенной на корпусе.

объектив микроскопа фото
Объектив для работ в смесях на основе глицерина

Вопрос о том, какой тип иммерсии лучше использовать, зависит от конкретных условий и требований поставленных задачей или экспериментом. Каждый из рассмотренных нами типов обладает своими особенностями и областью применения. Например, если нужно изображение с высоким разрешением, то масляная или глицериновая иммерсия более предпочтительны. Однако для исследования биологических препаратов, вода может быть более подходящей из-за своей схожести с составом биологических тканей или монтажного состава. Также важно учитывать правила и рекомендации производителя, так как их специфические рекомендации по выбору иммерсионной жидкости помогут в получении оптимальных результатов исследований.

Количество показов: 1377
04.10.2023
Понравилась статья? Поделитесь ей в ваших социальных сетях:

Возврат к списку